Jedinica za mutagenezu

Djelatnost

  • Ekogenetička istraživanja i biomonitoring populacija profesionalno izloženih različitim fizikalnim i kemijskim mutagenima: ionizirajućem zračenju (X- i γ-zračenje, radioaktivni izotopi), ne-ionizirajućem zračenju (mikrovalno zračenje, radiofrekventno zračenje), ultrazvuku te genotoksičnim kemikalijama (antineoplastični/citotoksični lijekovi, anestetici, pesticidi, organska otapala, teški metali i njihovi spojevi i dr.).
  • Procjena genotoksičnih učinaka provodi se na ljudskim limfocitima periferne krvi primjenom različitih genetičkih markera koji omogućuju detekciju ranih bioloških učinaka. Tu ubrajamo strukturne aberacije kromosoma, indukciju mikronukleusa i izmjene sestrinskih kromatida. Osjetljiva detekcija primarnih oštećenja genoma provodi se i s pomoću mikrogel elektroforeze, odnosno komet testa u alkalnim i neutralnim uvjetima. Standardne citogenetičke tehnike nadopunjuju se i sa specifičnim tehnikama bojenja kromatina, te tehnikom FISH. Za procjenu individualne osjetljivosti genoma primjenjuje se test lomljivosti kromatida. Genotoksični učinci utvrđuju se i s pomoću in vivo-mikronukleus testa na glodavcima.
  • Ekogenetička istraživanja u svrhu procjene vrijednosti biomarkera izloženosti, učinka i genomske osjetljivosti u općoj populaciji Republike Hrvatske.
  • Trajni biomonitoring populacija radnika profesionalno izloženih različitim mutagenima iz radnog okoliša (u skladu sa zakonodavstvom RH).
  • Procjena citogenetičkog rizika u slučajevima akcidenata.
  • Genotoksikološka istraživanja u uvjetima in vivo na laboratorijskim životinjama.
  • Genotoksikološka istraživanja u uvjetima in vitro na staničnim linijama ljudskog i životinjskog podrijetla.

CITOGENETIČKE USLUGE JEDINICE ZA MUTAGENEZU

1. Strukturne aberacije kromosoma u limfocitima periferne krvi (pretraga „kariogram“)

Kratki opis pretrage

Strukturne aberacije su oštećenja strukture kromosoma koja su vidljiva pod svjetlosnim mikroskopom. Razlikujemo kromatidne aberacije koje zahvaćaju samo jednu sestrinsku kromatidu jednoga ili više kromosoma i kromosomske aberacije koje uključuju obje sestrinske kromatide jednoga ili više kromosoma. Strukturne aberacije kromosoma mogu se također podijeliti na nestabilne i stabilne. Učestalost nestabilnih aberacija u limfocitima postupno se smanjuje nakon prestanka izlaganja mutagenu, dok se stabilne aberacije mogu otkriti i nakon mnogo godina. Nestabilne aberacije su dicentrični i prstenasti kromosomi, acentrični fragmenti te drugi asimetrični rearanžmani kromosoma. One mogu sterički ometati diobu stanice ili dovesti do gubitka genetičkog materijala u stanicama kćerima, čime se mijenja ekspresija pojedinih gena, a u konačnici nastupa i smrt stanice. Stabilne aberacije su uravnotežene translokacije, inverzije i drugi simetrični rearanžmani koji se diobom mogu prenijeti u stanice kćeri. Mogu se detektirati samo posebnim tehnikama bojanja kromosoma (metode pruganja, fluorescencijska in situ hibridizacija – FISH).
Analiza se zasniva na 48-satnome uzgoju limfocita iz periferne krvi u hranjivom mediju. Limfociti se u uvjetima in vitro na diobu potiču pomoću mitogena fitohemaglutinina. Za vrijeme rasta u kulturi, limfociti prolaze kroz sve faze staničnog ciklusa, međutim, da bi se mogla analizirati oštećenja na kromosomima, potrebno je zaustaviti diobu u metafazi, kada su oni najbolje uočljivi. To se postiže dodavanjem citostatika kolhicina u kulture tijekom posljednja tri sata kultiviranja. Kolhicin sprječava stvaranje diobenog vretena pa metafazni kromosomi ostaju raspršeni u citoplazmi. Po isteku 48. sata kultiviranja pristupa se izradi mikroskopskih preparata. U prvom koraku primjenom hipotonične otopine KCl odvajaju se i liziraju eritrociti, a talog u kojem su limfociti pročišćava se kroz nekoliko uzastopnih centrifuguranja i fiksiranja stanica otopinom fiksativa (metanol i ledena octena kiselina, 3:1). Pročišćena suspenzija limfocita nakapava se na predmetna stakalca. Mikroskopski preparati suše se na zraku, oboje citološkom bojom Giemsa i pregledavaju pod svjetlosnim mikroskopom (povećanje 1000x). Analizira se 200 metafaza prve in vitro diobe te utvrđuje ukupan broj i vrste oštećenja na kromosomima.

Kome je pretraga namijenjena?

Pretraga se provodi u okviru zdravstvenih pregleda radnika koje rade s izvorima ionizirajućih zračenja. Provođenje pretrage definirano je Pravilnikom o zdravstvenim uvjetima kojima moraju udovoljavati izloženi radnici, učestalosti pregleda te sadržaju, načinu i rokovima čuvanja podataka o tim pregledima (NN 111/2007).

Kriteriji za tumačenje nalaza pretrage

Učestalost i tip kromosomskih aberacija odgovara gornjoj kontrolnoj vrijednosti za opću populaciju Republike Hrvatske ukoliko se u 200 pregledanih metafaza utvrdi da je ukupan zbroj acentričnih fragmenata i dicentričnih kromosoma jednak 4.
Učestalost i tip kromosomskih aberacija odstupa od kontrolnih vrijednosti za opću populaciju Republike Hrvatske ukoliko se u 200 pregledanih metafaza utvrdi:

  • pet ili više acentričnih fragmenata,
  • da je ukupan zbroj acentričnih fragmenata i dicentričnih kromosoma jednak ili veći od 5,
  • dva ili više dicentričnih kromosoma,
  • jedan prstenasti kromosom

2. Izmjene sestrinskih kromatida (SCE, od engl. Sister Chromatid Exchanges)

Kratki opis pretrage

SCE su citološka očitovanja loma i ponovnog spajanja DNA na prividno homolognim mjestima dviju kromatida istog kromosoma. Indirektni su pokazatelj razine oštećenja prisutnih u DNA prije njenog udvostručavanja. Nastanak SCE uključuje lomove u 4 lanca DNA (tj. 2 dvostruke uzvojnice), prebacivanje odsječaka tih lanaca između kromatida istog kromosoma i njihovo ponovno spajanje na novim položajima.
Analiza SCE zasniva se na 72-satnome uzgoju limfocita iz periferne krvi uhranjivom mediju u prisutnosti 5-bromodeoksiuridina (analoga timina) koji se ugrađuje u novosintetizirani lanac DNA. Limfociti se u uvjetima in vitro na diobu potiču pomoću mitogena fitohemaglutinina. Za vrijeme rasta u kulturi, limfociti prolaze kroz sve faze staničnog ciklusa, međutim, da bi se mogla analizirati oštećenja na kromosomima, potrebno je zaustaviti diobu u metafazi, kada su oni najbolje uočljivi. To se postiže dodavanjem citostatika kolhicina u kulture tijekom posljednja tri sata kultiviranja. Kolhicin sprječava stvaranje diobenog vretena pa metafazni kromosomi ostaju raspršeni u citoplazmi. Po isteku 72. sata kultiviranja pristupa se izradi mikroskopskih preparata. U prvom koraku primjenom hipotonične otopine KCl odvajaju se i liziraju eritrociti, a talog u kojem su limfociti pročišćava se kroz nekoliko uzastopnih centrifuguranja i fiksiranja stanica otopinom fiksativa (metanol i ledena octena kiselina, 3:1). Pročišćena suspenzija limfocita nakapava se na predmetna stakalca. Mikroskopski preparati suše se na zraku, te zaštićeni od svjetla inkubiraju tijekom 10-ak dana nakon čega se obrade citološkim reagensima i naposljetku oboje bojom Giemsa. Zbog različitog afiniteta za vezanje boje, “nova” kromatida u koju se ugradio 5-bromodeoksiuridin oboji se svjetlije, pa se pod svjetlosnim mikroskopom jasno mogu razlikovati mjesta na kojima je došlo do izmjene odsječaka između “stare” i “nove” kromatide. Broj izmjena (tj. SCE) utvrđuje se na metafaznim kromosomima druge stanične diobe. Obično se pregledava 50 metafaza (povećanje 1000x) u kojima se broji ukupni broj SCE. Nalaz se izražava kao srednja vrijednost SCE po stanici uz raspon utvrđenih SCE.

Kome je pretraga namijenjena?

Pretraga se može primijeniti u okviru pregleda ispitanika koji su profesionalno izloženi mutagenima i karcinogenima. Pretraga se najviše koristi za procjenu oštećenja DNA koje izazivaju alkilirajući citostatici. Učestalost SCE u stanicama značajno raste nakon izlaganja genotoksičnim spojevima koji stvaraju kovalentne veze s DNA, odnosno na bilo koji način interferiraju s njenim metabolizmom ili popravkom.

Kriteriji za tumačenje nalaza pretrage

Gornja granica za normalan nalaz iznosi 7 izmjena.

3. Mikronukleus-test (MN)

Kratki opis pretrage

Mikronukleusi su samostalne kromatinske strukture koje su potpuno odvojene od jezgre. Nastaju kondenzacijom acentričnih kromosomskih fragmenata ili čitavih kromosoma zaostalih u anafazi koji se nisu ugradili u jezgre stanica kćeri. Promjer MN obično je između 1/16 do 1/3 promjera glavnih jezgara. Prisutnost MN smatra se kvantitativnim pokazateljem postojanja strukturnih i/ili numeričkih aberacija kromosoma koje su u ciljnim stanicama nastale pod utjecajem različitih genotoksičnih agensa u uvjetimain vitro i/ili in vivo.
Analiza se zasniva na 72-satnome uzgoju limfocita iz periferne krvi u hranjivom mediju. Limfociti se u uvjetima in vitro na diobu potiču pomoću mitogena fitohemaglutinina. Za vrijeme rasta u kulturi, limfociti prolaze kroz sve faze staničnog ciklusa, međutim, da bi se moglo otkriti mikronukleuse, potrebno je spriječiti diobu citoplazme prije negoli se roditeljska stanica podijeli u dvije stanice kćeri. To se postiže dodavanjem inhibitora citokineze, citohalazina B u 44.-tom satu kultiviranja. Po isteku 72. sata kultiviranja pristupa se izradi mikroskopskih preparata. U prvom koraku primjenom hipotonične otopine KCl odvajaju se i liziraju eritrociti, a talog u kojem su limfociti pročišćava se kroz nekoliko uzastopnih centrifuguranja i fiksiranja stanica otopinom fiksativa (metanol i ledena octena kiselina, 3:1). Pročišćena suspenzija limfocita nakapava se na predmetna stakalca. Mikroskopski preparati suše se na zraku, oboje citološkom bojom Giemsa i pregledavaju pod svjetlosnim mikroskopom (povećanje 1000x). Analizira se 1000 binuklearnih limfocita u kojima se utvrđuje ukupni broj MN. Usporedo se utvrđuje ukupni broj stanica s MN i raspodjela MN u stanicama.

Kome je pretraga namijenjena?

Pretraga se provodi u okviru prethodnih i periodičkih zdravstvenih pregleda radnika izloženih citostaticima (prema uputama Hrvatskog zavoda za zaštitu zdravlja i sigurnost na radu). Periodički pregled mikronukleus testom predviđa se svake dvije godine (osim ako je nalaz bio odstupajući, kada je obvezno učiniti kontrolu nakon 6 mjeseci).

Kriteriji za tumačenje nalaza pretrage

Gornja granica referentnih vrijednosti iznosi 13 MN na 1000 pregledanih binuklearnih stanica. Odstupanje nalaza mikronukleus testa veće od 10 % u odnosu na gornju granicu referentnih vrijednosti dijagnostičkog laboratorija znači da je radnik osjetljiviji i da je povećan rizik obolijevanja te se ne može zaposliti na tom radnom mjestu.

4. Komet-test

Kratki opis pretrage

Komet test ili mikroelektroforeza pojedinačnih stanica u agaroznom gelu djelotvorna je tehnika za brzo otkrivanje oštećenja i popravka u molekuli DNA. U ovome jednostavnom testu stanice se uklapaju u mikrogel agaroze. Pomoću otopine visoke koncentracije etilen-diamin-tetraoctene kiseline (EDTA) i detergenta liziraju se citoplazma i membranske strukture u stanici te se oslobađa ukupna DNA. Ona se zatim denaturira u alkalnom ili neutralnom puferu i podvrgava elektroforezi tijekom koje mali odsječci (fragmenti) DNA nastali jedno- ili dvolančanim lomovima putuju kroz pore gela prema anodi, dok glavnina DNA zbog velike molekularne mase nema tu sposobnost. Kraći fragmenti brže putuju kroz gel, pa zbog razlike u njihovoj duljini i brzini kretanja dolazi do razdvajanja prema veličini. DNA i obrasci putovanja njenih fragmenata nakon bojanja fluorescencijskom bojom pod mikroskopom su vidljivi kao “kometi”. Za njihovu analizu i mjerenje najčešće se koristi epifluorescencijski mikroskop i računalni program za analizu slike. Mjeri se najmanje 50 kometa na kojima se utvrđuju tri osnovna parametra: dužina repa kometa, intenzitet repa i repni moment. Dužina repa kometa predstavlja najveću udaljenost na koju su otputovali najkraći odlomljeni fragmenti DNA; obično se mjeri od sredine glave kometa ili od ruba glave i izražava u mikrometrima. Intenzitet repa označava postotak DNA koja je migrirala u rep, a izražava se u odnosu na ukupnu količinu DNA u kometu. Repni moment se obično definira kao umnožak dužine repa i % DNA u repu, a izračunava ga računalni program. Osnovna i najviše primjenjivana je izvedba komet-testa u alkalnim uvjetima koja omogućuje specifično otkrivanje jednolančanih lomova i mjesta osjetljivih na lužine (apurinska i apirimidinska mjesta nastala kao posljedica oštećenja molekule DNA), praćenje popravka stanične DNA te otkrivanje stanica u apoptozi i nekrotičnih stanica.

Kome je pretraga namijenjena?

Pretraga se provodi u okviru izvanrednih zdravstvenih pregleda radnika izloženih citostaticima (prema uputama Hrvatskog zavoda za zaštitu zdravlja i sigurnost na radu) u slučaju incidenta radi mjerenja primarnih oštećenja.

Dogodi li se incident na radnom mjestu prilikom kojeg je došlo do izravnog kontakta s visokim dozama citostatika potrebno je, ako je moguće unutar 2 sata, uzeti uzorak krvi i napraviti komet test.

Kriteriji za tumačenje nalaza pretrage

Pojedinačne vrijednosti za dužinu repa kometa izmjerene u leukocitima periferne krvi ispitanika opće populacije u Hrvatskoj iznose 12,10  do 15,91 μm (prosjek 14,25 μm; medijan 14,31 μm). Vrijednost 95-tog percentila iznosi 16,67 μm (prema: Kopjar N, Želježić D, Garaj-Vrhovac V. Evaluation of DNA damage in the white blood cells of healthy human volunteers using the alkaline comet assay and the chromosome aberration test. Acta Biochimica Polonica 2006;53(2):321-336.). Prihvatljivom razinom oštećenja smatraju se vrijednosti do 10 % DNA u repu kometa.

Oprema

Djelatnici